| |
|
|
|
|
|
|
|
|
Zastosowanie nowoczesnych technik mikroskopowych w badaniach własności kapilar dializatorów |
|
|
|
|
|
Andrzej Kowal, Stanisław Nowak, Władysław Sułowicz, Jacek A. Pietrzyk, Lidia Krawentek, Maciej Drożdż, Maria Nowogrodzka-Zagórska, Wojciech Bal
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Wstęp
W połowie lat osiemdziesiątych powstał nowy dział mikroskopii, tzw. skaningowa mikroskopia próbkująca (scanning probe microscopy), oznaczana akronimem SPM. Mikroskopia ta wykorzystuje bardzo precyzyjny stolik umożliwiający przesuwanie próbek w trzech kierunkach (x, y, z) z dokładnością nanometrową oraz specjalne próbniki (czujniki, sondy), które analizują takie własności powierzchni jak lokalna wysokość, gęstość stanów elektronowych, ładunek elektryczny, własności magnetyczne, obecność grup chemicznych itd. Pierwszym mikroskopem tego typu był opracowany w laboratorium IBM tzw. skaningowy mikroskop tunelowy (scanning tunneling microscope, STM), którego próbnik - ostrze z twardego metalu (Pt, Ir) działa zgodnie z prawem tunelowania elektronów [1]. Mikroskop STM wyznacza z rozdzielczością co najmniej 0,2 A tzw. rozkład gęstości elektronowej, co odpowiada rozmieszczeniu poszczególnych atomów na powierzchni badanego, przewodzącego materiału. STM umożliwia wyznaczenie topografii powierzchni materiałów przewodzących z dokładnością atomową, nic więc dziwnego, że twórcy tej techniki - Gert Binning i Heinz Rohrer otrzymali nagrodę Nobla w 1986 roku, wspólnie ze
swym nauczycielem prof. E. Ruską - konstruktorem skaningowego mikroskopu elektronowego (scanning electron microscopy, SEM).
Nową erę w badaniach biologicznych i medycznych otworzył opracowany przez Binninga, Quafe'a i Gerbera tzw. skaningowy mikroskop siłowy (scanning force microscope, SFM), częściej w literaturze anglojęzycznej oznaczany akronimem AFM (atomic force microscopy). Mikroskop ten korzysta z silnej zależności odległości od siły, która występuje pomiędzy dwoma zbliżającymi się elementami powierzchni (atomami, molekułami). Interakcje tutaj występujące obejmują oddziaływania van der Waalsa, dipolowe, elektrostatyczne itp. [3,4,9, 23]. Stosowany w tej technice próbnik z twardego materiału w kształcie piramidy, umożliwia wyznaczenie z nanometrowi rozdzielczością topografii powierzchni także dla materiałów nie przewodzących. Ogromną zaletą AFM w porównaniu do SEM jest możliwość oglądania próbek przy dostępie powietrza - a także w roztworach - bez konieczności stosowania drogiego układu próżniowego. Technika AFM nie wymaga także pokrywania biologicznych i medycznych preparatów warstwą przewodzącą (zło ta lub węgla) jak to wymaga technika SEM. Biorąc pod uwagę fakt, że techniki SPM jako jedyne techniki mikroskopowe odwzorowują powierzchnię w trzech wymiarach (3D) łatwo zrozumieć, że AFM udostępnia nowe, wcześniej nie znane obszary badawcze w biologii i medycynie [4,6].
Celem niniejszej pracy było zastosowanie obecnie dostępnych technik mikroskopowych do poznania struktur kapilar stosowanych w dializatorach.
Materiały i metodyka
Badaniom poddano kapilary dializatorów wykonanych z najczęściej stosowanego materiału, tj polisulfonu (dializator F4 firmy Fresenius) oraz kuprofanu (dializator GFE 09 firmy Gambro). Wykonano obserwacje dla wewnętrznej ściany kapilary rozciętej na mikrotomie stycznie oraz przekroju ścianki kapilary uzyskanego przez zatopienie wiązki kapilar w poliuretanie, a następnie przecięcie ich w płaszczyźnie prostopadłej do osi kapilar.
Ocenę kapilar na przekrojach stycznych i poprzecznych przeprowadzono stosując optyczny system pomiarowy OMV firmy Digital Instruments, wyposażony w kamerę CCD (Nikon) oraz obiektyw o 10 krotnym powiększeniu.
Do oceny powierzchni wewnętrznej kapilar zastosowano elektronowy mikroskop skaningowy (SEM) Jeol JSM 35CF. Dializatory kapilarne po zakończeniu dializy i wypłukaniu przedziału krwi solą fizjologiczną przepłukiwano 0,1 molarnym buforem kakodylowym o pH 7,4 a następnie napełniano roztworem 0,25% glutaraldehydu w tym buforze. Po otwarciu dializatora wycinano kapilary, które umieszczano w tym roztworze na 16 godzin a następnie poddawano dalszemu utrwalaniu w zbuforowanym 2,5% glutaraldehydzie przez 1 godzinę. Po przepłukaniu buforem cięte stycznie do powierzchni kapilary odwadniano we wzrastających stężeniach alkoholu, suszono w punkcie krytycznym CO2 w aparacie Andersona i napylano złotem. Analizę materiału w SEM prowadzono według podobnych zasad jak innych materiałów biologicznych [21].
Do oceny topografii powierzchni w skali nanometrów stosowano mikroskop elektronowy SPM typu NanoScope firmy Digital Instruments (USA) posiadający opcję pomiarową AFM. Pomiary AFM wykonano przy dostępie powietrza, stosując jako sposób pomiaru tzw, contact mode, zapewniający stały, lokalny nacisk piramidy pomiarowej na próbkę. Stosowano końcówki (tipy) firmy Digital Instruments wykonane z azotku krzemu o stałej siłowej w zakresie od 0,12 do 0,58 N/m. Zasadę działania techniki AFM schematycznie przedstawiono na rycinie 1. Posługując się matematyczną metodą wyliczano szorstkości powierzchni (roughness analysis) na podstawie wyliczenia odchyłki średniokwadratowej (ront mean square, RMS) dopasowującej linię średnią dla pikseli tworzących obraz skrawka o wymiarach 1,7 x 1,7 mikrometra, dla kapilary kuprofanowej i polisulfonowej, na 5 obszarach skrawków.
Wyniki Obserwacje skrawków kapilar przekrojonych poprzecznie i stycznie pozwoliły na wybór właściwego miejsca do przeprowadzania analiz nanoskopowych (rycina 2a, 2b).
 Rycina 2a
Obraz OMV przekroju poprzecznego ścianki kapilary dializatora polisulfonowego (ps) Fresenius. Strzałkami zaznaczono miejsca skanowania mikroskopem AFM
|
|
|
Rycina 2b
Obraz SEM przekroju podłużnego ściany kapilary dializatora polisulfonowego (ps) Fresenius. Strzałkami zaznaczono miejsca skanowania mikroskopem AFM
|
|
|
Analiza w SEM podłużnie przekrojonych kapilar po hemodializie wykazała na ich wewnętrznej powierzchni osadzone elementy komórkowe (rycina 3a), głównie leukocyty (rycina 4a) i wykazujące cechy aktywacji płytki krwi (rycina 4b).
|
|
|
Rycina 3a
Obrazy SME wewnętrznej powierzchni kapilary dializatora przed reutylizacją, zarejestrowane przy powiększeniu ok. 500 razy. Widoczne elementy morfotyczne krwi.
|
|
|
Rycina 4a
Obrazy SME elementy morfotyczne krwi na powierzchni kapilary przed reutylizacją, zarejestrowane przy powiększeniu ok. 2000 razy. Widoczne pełzajace po powierzchni błony neutrofile.
|
|
|
Rycina 4b
Obrazy SME elementy morfotyczne krwi na powierzchni kapilary przed reutylizacją, zarejestrowane przy powiększeniu ok. 2000 razy. Widoczne zaaktywowane płytki krwi z licznymi długimi wypustkami oraz agregaty płytkowe Przeprowadzony proces reutylizacji usuwa skutecznie elementy morfotyczne krwi z powierzchni błon dializacyjnych tak kuprofanowych jak i polisulfonowych (rycina 3b).
|
|
|
Rycina 3b
Obrazy SME wewnętrznej powierzchni kapilary dializatora przed reutylizacją, zarejestrowane przy powiększeniu ok. 500 razy. Proces reutylizacji skutecznie usunął osadzone na powierzchni elementy morforyczne krwi.
Obrazy ścian kapilar uzyskane w AFM wykazały różną strukturę wewnętrznych kanałów błon kuprofanowych i polisulfonowych. Wyniki pomiarów wskazują, że szorstkość powierzchni kuprofanu wyrażona wartością RMS jest większa dla przekrojów poprzecznych w porównaniu do przekrojów stycznych i wynosi odpowiednio od 40-66 i 40-47nm. Analogiczne wartości RMS dla polisulfonu wynoszą 30-31 nm (poprzecznie) i 39-40 nm (stycznie). Średnica kanałów błony kuprofanowej w różnych jej punktach nie przekraczała 150 nm natomiast w błonach polisuifonowych - 380 nm. Przebieg kanałów w błonie kuprofanowej był bardziej kręty (rycina 5a i 5b).
Rycina 5a Obrazy AFM kapilary polisulfonowej dializatora Fresenius.
|
|
|
Rycina 5b
Obrazy AFM wewnętrznej powierzchni kapilary kuprofanowej dializatora Gambro.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
